凱氏定氮法測定蛋白質分為哪幾個過程

蛋白質被認為是構成生物體細胞組織的重要成分。食物中的蛋白質是人體中氮的*來源，具有糖類和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白質區(qū)別于其他有機化合物的重要標志。在檢驗食品中蛋白質時，通常是先檢定出食品中的總氮量，然后乘以蛋白質換算系數，以此得到蛋白質含量。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作為標準檢驗方法。凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。

 

原理

向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然后加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機氮轉化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。

 

樣品消化

濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質會分解為氨，然后氨與硫酸結合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點，一般情況下，純硫酸的沸點在340 ℃左右，但是在添加硫酸鉀后，可提高至400 ℃以上。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀，否則會因為溫度過高，使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點的到達，有機物全部消化*后，溶液呈現清澈的藍綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應的指示劑。

 

蒸餾

消化液中的硫酸銨在堿性環(huán)境下會轉化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測定結果，所以水蒸氣發(fā)生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱堿鹽，需要足夠的堿液使結合態(tài)的氨*反應并釋放出來，這個過程中的氫氧化鈉一定要過量，過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應生成棕紅色的碘化汞銨化合物。

 

吸收

加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時指示劑的變色反應。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。

 

滴定

待吸收*后，用硫酸或者鹽酸標準溶液進行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結果的準確性，必須按照要求進行配制和標定?；旌现甘緞┰谥行匀芤褐谐驶疑?，滴定終點時液體呈灰色。